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现场大量生物检材的自动化提取应用

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随着司法诉讼进程对证据质量要求的不断提高，重特大案件的现场重建直接导致生物检材的送检量大幅度提升，时效要求也越来越高。而现场送检的生物检材种类繁多，以往应用Chelex-100法手工操作耗时长、易污染，手工磁珠法无法批量进行，传统方式已无法适应形势的要求[1]，寻求高通量的生物检材DNA自动化提取应用已迫在眉睫。本研究通过采用AutoLys STAR自动化工作站结合微量检材DNA提取试剂盒建立生物检材DNA自动化检验体系，以实现批量的自动化操作，杜绝交叉污染，有效提升检案的效率和质量。 1 材料与方法 1.1 样本本实验室日常受理检验的案件生物检材1552份，其中包括血痕813份，烟蒂237份，混合斑78份，肋软骨27份，带毛囊毛发11份，头套、手套、口罩、衣服、帽子、瓶口、杯口、果核、牙刷、触摸类（含工具、把手、线头、印痕）等接触细胞检材386份。 1.2 仪器和试剂 AutoLys STAR自动化工作站（瑞士Hamilton公司），9700型PCR扩增仪、3130xl型遗传分析仪、Gene-Mapper ID v3.2软件（美国AB公司）。Identifiler?Plus试剂盒（美国AB公司），脱落细胞提取仪（公安部物证鉴定中心），EZ-tape脱落细胞粘取器（公安部物证鉴定中心，以下简称EZ-tape），微量检材DNA提取试剂盒（烟台澳斯邦生物研发有限公司）。 1.3 方法 1.3.1 检材处理血痕、烟蒂、肋软骨、带毛囊毛发、口罩：剪取或切取适量检材，置入AutoLys Tube管（AutoLys STAR自动化工作站专用裂解管）。混合斑：剪取检材适量，使用差异裂解法去除女性物质，将沉渣用50μL纯水混匀后加入1mol/L DTT 10μL，置入AutoLys Tube管。头套、手套、帽子：用EZ-tape粘取，揭下基座上的胶带置入AutoLys Tube管。衣服：用脱落细胞提取仪吸取衣领和袖口处，剪取第二层滤膜置入AutoLys Tube管。瓶口、杯口、果核、牙刷：采用干湿两步法，直接用棉签提至AutoLys Tube管中。触摸类：先用棉签干湿两步法擦拭，再用EZ-tape粘取，揭下基座上的胶带置入AutoLys DNA提取编写检材登记表，扫描裂解管底部二维码，登记对应的样本编号，填写样本的洗脱体积和PCR建立时需要分配的对应样本的DNA溶液模板体积。将装有检材的AutoLys Tube管依次放入对应载架上。 1.3.3 PCR扩增及其分型采用10 μL体系的Identifiler?Plus试剂盒在9700型PCR扩增仪上按标准程序29个循环进行复合扩增，其中Master Mix 4μL、Primer Set 2μL、模板2μL、超纯水2μL。在3130xl型遗传分析仪上进行电泳检测，用GeneMapper ID v3.2软件进行分析。该试剂盒可以对共15个STR基因座进行分型检测，本次以获得性别及13个以上STR基因座明确分型的为成功[2-5]。 2 结果 1552例生物检材总STR检测成功率为90.40%。其中肋软骨、毛发成功率为100.00%；血痕、烟蒂、瓶口等检材成功率也较高；头套、手套、口罩、衣服、帽子、瓶口、杯口、果核、牙刷、触摸类等多类接触细胞平均检出率为68.91%，其中触摸类检材成功率则较低（表1）。表1 采用自动化工作站提取生物检材DNA的检验结果检出率/ %血痕.89烟蒂.36混合斑.46肋软骨.00毛发.00头套、手套、口罩、衣服、帽子检材份数STR基因座检验检出13个位点/份数.92瓶口、杯口、果核、牙刷.22触摸类.88合计.40 3 讨论自动化工作站为常见生物性检材的DNA提取提供了一个高效、精确、有用的平台[6]，已在人员血样DNA数据库建设中起着重要作用[7]。而基于功能磁性纳米颗粒的样本提取与处理技术（即磁珠分离技术）可以保证实验结果的稳定，避免人工操作引起的误差[8]。将自动化工作站与磁珠法DNA提取技术相结合的磁珠DNA自动提取系统正逐步普及，已在法医应用DNA数据库建设和案件检验中得到应用。 AutoLys STAR自动化工作站的试剂平台和实验程序均为开放式，可兼容包括市面上各种磁珠试剂在内的多种常见提取方法，未来DNA检验新方法同样可在该平台得到应用。本实验案例检验采用的微量检材DNA提取试剂盒中磁珠颗粒较小、吸附效率高，适用于法医DNA实验室常见生物检材的提取。微量检材DNA提取试剂盒配合AutoLys STAR自动化工作站可自动完成样本裂解、磁珠吸附、洗涤和洗脱纯化步骤，样本完全闭盖裂解，杜绝交叉污染，无需人工进行离心、过滤等操作，在本实验中得到了较理想的检出效率。随着犯罪分子反侦查意识不断增强，案件现场遗留的常规检材越来越少，办案人员逐渐将勘查重点转向微量物证，而这类检材的检验结果对案件定性乃至侦破起着关键作用。该工作平台加入了超滤步骤，使模板得到充分富集、浓缩，在本实验中针对接触类检材，特别是触摸类检材的检出率同比本实验室以往检测、高林林等[4-5]检测结果均有大幅提升。在使用该工作平台中我们发现，该平台确能实现大通量检验的目的，对于现场大量生物检材的送检，操作人员只需将样本检材放入指定位置，启动软件即可自动完成DNA提取，实现了全系统的自动化，无需再行人工干预，有效节约了宝贵的人力；同时，该平台还引入了二维码，避免了人为差错，可保证检材从进入实验室到得出DNA检验结果，中间每一步过程都有记录，都可以得到追溯，适应了当前实验室开展认可与资质认定工作的要求。综上所述，本研究利用自动化工作站建立的标准化流程，可以批量提取常见案件中生物检材DNA，特别是应用于侵财类案件普遍送检接触类检材的提取，不仅具备高效、稳定、操作简便、有效防控污染等特点[9]，减少人力资源，易于实现检验的标准化、规范化和自动化，且该自动化工作站为模块化设计，便于后期根据工作需求进行升级，可在常规检案之外的检测工作中得到便捷应用。